Microscopio Epifluorescencia triocular, serie 158-358, revolver séxtuple, 1000X

Ciertas sustancias en virtud de su estructura química son capaces de emitir luz de una determinada longitud de onda tras ab- sorber luz de una longitud de onda menor. Esta propiedad es denominada fluorescencia y es característica de ciertas moléculas como por ejemplo colágeno, elastina, lignina o clorofila y de una serie de compuestos químicos, los fluorocromos (FITC, DAPI, TRITC) con aplicaciones muy numerosas y variadas; entre ellas dos técnicas de rutina en laboratorios de investigación y diagnós tico para las cuales se hace indispensable el uso del microscopio de fluorescencia:

- Inmunofluorescencia (IF): consiste en la detección y marcaje de determinadas moléculas de interés en biopsias o cortes histológicos mediante la utilización de anticuerpos específicos conjugados con un determinado fluorocromo lo que permite el diagnóstico de ciertas enfermedades.

- Hibridación in situ con fluorescencia (FISH): consiste en la hibridación de determinados fragmentos de DNA con sondas marcadas con fluorocromos, permitiendo la detección de mutaciones y alteraciones genéticas y resultando por tanto de gran utilidad en el diagnóstico prenatal y la detección y diagnóstico de ciertos tumores.

Fundamentos teóricos:

La epifluorescencia o fluorescencia de luz reflejada se basa en la incidencia de un haz de luz de una determinada longitud de onda sobre la muestra a observar. Esta muestra absorbe la energía de la luz incidente emitiendo a su vez luz a una longitud de onda mayor.

Para permitir este fenómeno es necesaria la utilización de un sistema de filtros (cubos) con los siguientes componentes:

- Filtro de excitación (EX): selecciona la luz de la longitud de onda incidente.

- Espejo dicroico (DM): refleja la luz de ciertas longitudes de onda mientras que deja pasar la luz de longitudes de onda mayores. Refleja, por tanto, la luz de excitación haciendo que llegue a la muestra mientras que deja pasar la luz emitida por la sustancia fluorescente.

- Filtro de emisión o barrera (BA): selecciona la longitud de onda fluorescente emitida por el fluorocromo permitiendo que llegue hasta los oculares. En el siguiente gráfico se muestra un esquema del funcionamiento del microscopio de epifluorescencia. La luz procedente de la fuente (lámpara de mercurio), atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo. Esta luz se refleja en un espejo dicroico e incide sobre la muestra, excitando al fluorocromo que emite fotones de una longitud de onda mayor que la incidente. La luz emitida por la muestra no se refleja sino que atraviesa el espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo, permitiendo que llegue a los oculares.